Chromatographie HPLC : 20 exercices corrigés pour maîtriser les calculs et l’interprétation

La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est aujourd’hui l’une des techniques analytiques les plus utilisées en laboratoire pharmaceutique, agroalimentaire, environnemental et chimique. Elle permet de séparer, identifier et quantifier les composés d’un mélange avec une grande précision.

Comprendre la théorie est indispensable, mais la réussite en HPLC repose surtout sur la pratique. Les techniciens et analystes sont régulièrement amenés à interpréter un chromatogramme, calculer une résolution, vérifier un facteur de capacité, déterminer la concentration d’un analyte ou diagnostiquer une anomalie sur un système chromatographique.

Cette série d’exercices corrigés couvre les principales notions rencontrées en formation, en BTS, licence, master, école d’ingénieur ainsi que dans les laboratoires de contrôle qualité.

Objectifs de cette série d’exercices

À la fin de ces exercices, vous serez capable de :

interpréter un chromatogramme ;
calculer un temps de rétention ;
déterminer un facteur de capacité (k’) ;
calculer la résolution entre deux pics ;
calculer le facteur de sélectivité α ;
déterminer le nombre de plateaux théoriques ;
calculer une concentration par étalonnage ;
identifier les causes d’un mauvais chromatogramme ;
choisir une colonne adaptée ;
optimiser une méthode HPLC.

Exercice 1 — Identifier les éléments d’un chromatogramme

Énoncé

Le chromatogramme présente quatre pics.

Identifier :

le temps mort (t₀)
le temps de rétention (tR)
l’aire du pic
la hauteur du pic

Correction

Le temps mort correspond au passage d’un composé non retenu.

Le temps de rétention correspond au sommet du pic.

L’aire du pic représente la quantité de substance.

La hauteur du pic est utilisée dans certains calculs mais l’aire reste la mesure quantitative de référence.

Exercice 2 — Calcul du facteur de capacité

Énoncé

Temps mort :

1,2 min

Temps de rétention :

6,8 min

Calculer k’.

Correction

Formule :

k’ = (tR − t₀) / t₀

Calcul :

k’ = (6,8 − 1,2) / 1,2

k’ = 4,67

Le composé est correctement retenu.

Exercice 3 — Calcul de la résolution

Deux pics présentent :

tR₁ = 5,20 min

tR₂ = 5,90 min

Largeurs :

0,28 min

0,32 min

Calculer la résolution.

Correction

Rs = 2(tR₂−tR₁)/(w₁+w₂)

Rs = 2×0,70 /0,60

Rs = 2,33

Une résolution supérieure à 1,5 indique une excellente séparation.

Exercice 4 — Calcul du facteur de sélectivité

Calculer α.

k₁ = 2,6

k₂ = 3,8

Correction

α = k₂/k₁

α = 3,8 /2,6

α = 1,46

La colonne sépare correctement les deux composés.

Exercice 5 — Nombre de plateaux théoriques

Temps de rétention :

8,5 min

Largeur du pic :

0,24 min

Calculer N.

Correction

N = 16(tR/W)²

N = 16(8,5/0,24)²

N ≈ 20 080

La colonne possède une excellente efficacité.

Exercice 6 — Facteur d’asymétrie

Le facteur As mesuré est :

1,45

Interpréter.

Correction

Un facteur proche de 1 indique un pic symétrique.

Entre 1 et 1,5 :

pic acceptable.

Au-delà de 2 :

la méthode doit être optimisée.

Exercice 7 — Lecture d’un chromatogramme

Le chromatogramme présente :

un pic à 3,2 min
un pic à 7,6 min
un pic à 11,8 min

Quel composé est élué en premier ?

Correction

Le composé ayant le temps de rétention le plus faible.

Réponse :

le premier pic.

Exercice 8 — Calcul d’une concentration

Équation d’étalonnage

y = 15432x + 218

Aire :

31250

Déterminer la concentration.

Correction

31250 = 15432x +218

x = 2,01 mg/L

Exercice 9 — Identifier une dérive de ligne de base

Le chromatogramme montre une ligne de base montante.

Quelle peut être la cause ?

Correction

Causes possibles :

gradient
température instable
détecteur mal équilibré
bulles d’air
contamination

Exercice 10 — Pression anormalement élevée

La pression augmente progressivement.

Donner trois causes possibles.

Correction

colonne bouchée
filtre encrassé
phase mobile contaminée

Exercice 11 — Temps de rétention instable

Pourquoi les temps de rétention changent-ils ?

Correction

débit variable
température fluctuante
composition du gradient incorrecte
fuite

Exercice 12 — Choix d’une colonne

Vous devez analyser :

caféine
paracétamol

Quelle colonne choisir ?

Correction

Une colonne C18 en phase inverse convient dans la majorité des cas.

Exercice 13 — Choix du détecteur

Quel détecteur utiliser pour :

caféine
vitamine B12

Correction

Détecteur UV ou PDA.

Exercice 14 — Identifier un pic fantôme

Le chromatogramme présente un petit pic apparaissant dans tous les essais.

Quelle est la cause probable ?

Correction

contamination
mémoire de l’autosampler
solvant impur

Exercice 15 — Calcul d’un rendement d’extraction

Avant extraction :

15 mg/L

Après extraction :

13,2 mg/L

Calculer le rendement.

Correction

Rendement = 13,2/15 ×100

88 %

Exercice 16 — Optimisation d’une séparation

Deux pics se chevauchent.

Comment améliorer la résolution ?

Correction

diminuer le débit
modifier le gradient
changer la colonne
diminuer la température
augmenter la longueur de colonne

Exercice 17 — Identifier le meilleur chromatogramme

Comparer deux chromatogrammes :

Pics séparés.

Pics chevauchés.

Correction

Le chromatogramme A est préférable.

Exercice 18 — Validation d’une méthode

Quels paramètres doivent être validés ?

Correction

exactitude
fidélité
précision
linéarité
robustesse
spécificité
LOD
LOQ

Exercice 19 — Contrôle qualité

Une impureté dépasse la limite spécifiée.

Que faire ?

Correction

vérifier l’étalonnage ;
répéter l’analyse si la procédure le permet ;
examiner le chromatogramme et les paramètres système ;
rechercher une contamination éventuelle ;
appliquer la procédure qualité du laboratoire avant toute décision concernant le lot.

Exercice 20 — Cas pratique complet

Énoncé

Une analyse HPLC donne :

Temps mort : 1,0 min
Pic A : 3,8 min
Pic B : 5,9 min
Largeur A : 0,22 min
Largeur B : 0,31 min
Aire du pic B : 42 350
Équation d’étalonnage :

y = 18 200x + 450

Déterminer :

Le facteur de capacité du pic B.
La résolution entre A et B.
La concentration correspondant au pic B.

Correction

1. Facteur de capacité

k’ = (5,9 − 1,0) / 1,0 = 4,9

2. Résolution

Rs = 2 × (5,9 − 3,8) / (0,22 + 0,31)

Rs = 2 × 2,1 / 0,53

Rs ≈ 7,92

La séparation est excellente.

3. Concentration

42 350 = 18 200x + 450

x = (42 350 − 450) / 18 200

x ≈ 2,30 mg/L

Conseils pour réussir les exercices HPLC

📖 Comprendre le rôle de chaque composant de l’appareil avant d’effectuer les calculs.
📊 Savoir lire un chromatogramme est aussi important que connaître les formules.
🧮 Vérifier les unités (minutes, mL/min, mg/L, µg/mL).
🧪 Maîtriser les principaux paramètres chromatographiques : temps de rétention, résolution, facteur de capacité, sélectivité, nombre de plateaux et asymétrie.
✅ Interpréter les résultats en tenant compte du contexte analytique et des critères d’acceptation du laboratoire.

🧪 Exercices HPLC corrigés par niveau

Une progression visuelle et pratique pour apprendre à lire un chromatogramme, calculer les paramètres chromatographiques, optimiser une méthode et résoudre des situations réelles de laboratoire.

Ces exercices avancés de chromatographie HPLC sont classés en quatre niveaux. Chaque activité associe un énoncé, un schéma, une formule, une correction détaillée et une interprétation analytique.

🟢

Niveau 1 — Initiation

Lecture d’un chromatogramme, temps mort, temps de rétention et ordre d’élution.

🔵

Niveau 2 — Intermédiaire

Facteur de capacité, résolution, sélectivité et efficacité de colonne.

🟠

Niveau 3 — Avancé

Étalonnage, dosage, rendement, validation et diagnostic chromatographique.

🔴

Niveau 4 — Expert

Développement de méthode, optimisation multicritère et investigation laboratoire.

Schéma global d’une analyse HPLC

🧴 Phase mobile

→

⚙️ Pompe

→

💉 Injection

→

🧪 Colonne

→

🔦 Détection

→

📈 Chromatogramme

Niveau 1 — Comprendre et lire un chromatogramme

Exercices d’initiation aux temps de rétention et à l’ordre d’élution.

Exercice 1 — Identifier les pics chromatographiques

Énoncé

Un mélange contient trois substances A, B et C. Le chromatogramme montre trois pics aux temps suivants :

Pic A : 2,4 min
Pic B : 5,8 min
Pic C : 8,1 min

Identifiez le premier composé élué et le composé le plus retenu.

Difficulté : facile

Voir la correction

Le premier composé élué est A, car son temps de rétention est le plus faible : 2,4 min.

Le composé le plus retenu est C, car il quitte la colonne après 8,1 min.

L’ordre d’élution est donc : A → B → C.

Schéma du chromatogramme

Temps de rétention →

Exercice 2 — Distinguer temps mort et temps de rétention

Énoncé

Une substance non retenue traverse la colonne en 1,1 min. Un analyte apparaît à 6,3 min.

Déterminez le temps mort t₀ et le temps de rétention t_R.

Voir la correction

Le temps mort correspond au passage d’une substance non retenue : t₀ = 1,1 min.

Le temps de rétention de l’analyte est : t_R = 6,3 min.

Repère temporel

Injection
0 min

→

Temps mort
1,1 min

→

Analyte
6,3 min

Niveau 2 — Calculer les performances chromatographiques

Facteur de capacité, résolution, sélectivité et nombre de plateaux.

Exercice 3 — Calcul du facteur de capacité k′

Données

Temps mort : t₀ = 1,2 min
Temps de rétention : t_R = 6,8 min

k′ = (tR − t0) / t0

Calculez le facteur de capacité.

Voir la correction

k′ = (6,8 − 1,2) / 1,2

k′ = 5,6 / 1,2 = 4,67

Le facteur de capacité est 4,67. Le composé présente une rétention satisfaisante.

Lecture schématique

t0
1,2 min

→

Zone de rétention
5,6 min

→

tR
6,8 min

Exercice 4 — Calcul de la résolution entre deux pics

Données

tR1 = 5,20 min
tR2 = 5,90 min
w1 = 0,28 min
w2 = 0,32 min

Rs = 2 × (tR2 − tR1) / (w1 + w2)

Voir la correction

Rs = 2 × (5,90 − 5,20) / (0,28 + 0,32)

Rs = 1,40 / 0,60 = 2,33

La résolution est 2,33. Les deux composés sont nettement séparés.

Interprétation visuelle

Deux pics séparés — Rs supérieur à 1,5

Exercice 5 — Calcul de l’efficacité de la colonne

Données

Temps de rétention : 8,5 min
Largeur du pic à la base : 0,24 min

N = 16 × (tR / w)²

Voir la correction

N = 16 × (8,5 / 0,24)²

N ≈ 20 069 plateaux

La colonne présente une efficacité élevée, sous réserve de respecter la formule et le type de largeur de pic utilisés.

Effet de l’efficacité

Pic large
N faible

→

Pic étroit
N élevé

Niveau 3 — Dosage, validation et diagnostic

Étalonnage, concentration, rendement et anomalies de fonctionnement.

Exercice 6 — Calcul d’une concentration par étalonnage

Données

La droite d’étalonnage est :

y = 15 432x + 218

L’aire mesurée est y = 31 250.

Calculez la concentration x.

Voir la correction

x = (31 250 − 218) / 15 432

x ≈ 2,01 mg/L

La concentration de l’analyte est 2,01 mg/L.

Principe de l’étalonnage

Concentration connue

→

Aire du pic

→

Droite y = ax + b

→

Échantillon inconnu

Exercice 7 — Diagnostic d’une pression élevée

Situation

La pression initiale du système est de 145 bar. Après vingt injections, elle atteint progressivement 230 bar.

Proposez une démarche de diagnostic logique.

Voir la correction

Étape 1 : vérifier la viscosité et la composition de la phase mobile.

Étape 2 : inspecter le filtre de ligne et la précolonne.

Étape 3 : déconnecter la colonne et contrôler la pression du système.

Étape 4 : examiner la colonne, le frit d’entrée et les risques de précipitation.

Étape 5 : vérifier la préparation et la filtration des échantillons.

Arbre de diagnostic

Pression élevée

→

Retirer la colonne

→

Pression normale ?

Oui
Colonne bouchée

Non
Circuit ou filtre bouché

Exercice 8 — Calcul d’un rendement d’extraction

Données

Concentration théorique : 15 mg/L
Concentration mesurée après extraction : 13,2 mg/L

Rendement = (C mesurée / C théorique) × 100

Voir la correction

Rendement = (13,2 / 15) × 100

Rendement = 88 %

Le rendement d’extraction est de 88 %.

Schéma du rendement

15 mg/L
avant extraction

→

Extraction

→

13,2 mg/L
récupérés

Niveau 4 — Développement de méthode et investigation

Cas avancés d’optimisation, séparation critique et décision analytique.

Exercice 9 — Optimiser deux pics partiellement coélués

Situation

Deux impuretés apparaissent à 7,42 min et 7,55 min. La résolution mesurée est de 0,86. La méthode utilise :

une colonne C18 de 100 mm ;
un débit de 1,2 mL/min ;
un gradient rapide ;
une température de 40 °C.

Proposez quatre leviers d’optimisation et expliquez leur effet.

Voir la correction

1. Réduire la pente du gradient : augmente le temps disponible pour séparer les deux impuretés.

2. Réduire le débit : peut améliorer les échanges avec la phase stationnaire.

3. Tester une colonne plus longue : augmente le nombre de plateaux théoriques.

4. Modifier la sélectivité : changer le pH, le solvant organique ou la chimie de phase stationnaire peut déplacer différemment les deux pics.

Leviers d’optimisation

Sélectivité α

Rétention k′

Efficacité N

Gradient

Colonne

Débit

Température

Exercice 10 — Cas complet de conformité système

Données du contrôle

Résolution minimale exigée : 1,5
Résolution obtenue : 1,72
Facteur d’asymétrie maximal : 2,0
Facteur obtenu : 1,38
RSD des aires maximal : 2,0 %
RSD obtenu : 1,4 %
Nombre minimal de plateaux : 5 000
Nombre obtenu : 8 650

Le système est-il conforme ?

Voir la correction

La résolution de 1,72 est supérieure au minimum de 1,5.

Le facteur d’asymétrie de 1,38 est inférieur à la limite de 2,0.

Le RSD de 1,4 % respecte la limite de 2,0 %.

Le nombre de plateaux de 8 650 dépasse le minimum de 5 000.

Conclusion : le système est conforme aux quatre critères présentés.

Grille de décision

Rs
✅ Conforme

Asymétrie
✅ Conforme

RSD
✅ Conforme

Plateaux
✅ Conforme

Exercice 11 — Investigation d’un résultat hors spécification

Situation professionnelle

Une impureté est mesurée à 0,28 %, alors que la spécification maximale est de 0,20 %. Le chromatogramme présente également un léger épaulement sur le pic principal.

Construisez une démarche d’investigation analytique sans conclure immédiatement à la non-conformité du lot.

Voir la correction

1. Vérifier les données brutes : intégration, identification du pic, paramètres de méthode et conformité du système.

2. Examiner la préparation : dilution, pesée, verrerie, standard, filtration et stabilité des solutions.

3. Vérifier l’instrument : autosampler, colonne, pression, carry-over et état du détecteur.

4. Examiner l’épaulement : rechercher une coélution ou une intégration incorrecte.

5. Documenter l’investigation : appliquer la procédure qualité du laboratoire avant toute répétition ou décision.

Schéma d’investigation

Résultat OOS

→

Données brutes

→

Préparation

Instrument

→

Méthode

→

Conclusion documentée

🧪 Simulateur de laboratoire HPLC

Préparez une méthode, lancez une séquence analytique, observez le chromatogramme et diagnostiquez les performances du système HPLC.

État du système Prêt

Pression 0 bar

Débit 1,00 mL/min

Température 30 °C

Temps d’analyse 0,0 min

⚙️ Paramètres de la méthode

Mission analytique

Colonne chromatographique

Débit 1,00 mL/min

Solvant organique 40 %

Température de colonne 30 °C

Volume injecté 10 µL

Longueur d’onde

Préparation de l’échantillon

État de la colonne

HPLC System LC-240

Système en attente

🧴 Solvants Phase mobile

→

⚙️ Pompe Débit contrôlé

→

💉 Autosampler Injection

→

🧪 Colonne Séparation

→

🔦 Détecteur UV Acquisition

→

📊 CDS Intégration

Chromatogramme en temps réel Méthode prête

Pression calculée —

Résolution critique —

Nombre de plateaux —

Asymétrie —

Temps de rétention 1 —

Temps de rétention 2 —

RSD des aires —

Conformité système —

🔎 Diagnostic du laboratoire

Sélectionnez les paramètres de la méthode puis lancez l’analyse. Le simulateur évaluera la pression, la résolution, l’efficacité et la conformité du système.

🎯 Objectif de la mission

Obtenir une séparation exploitable tout en respectant les critères de conformité du système chromatographique.

Résolution Viser Rs ≥ 1,50

Asymétrie Viser 0,80 à 1,80

RSD des aires Viser ≤ 2,00 %

🧪 Approfondir la chromatographie HPLC

Après ces exercices corrigés, poursuivez votre apprentissage avec le guide pratique HPLC avec simulateurs et outils de laboratoire . Vous y trouverez des calculateurs chromatographiques, des schémas de fonctionnement, des outils d’interprétation des chromatogrammes et un simulateur de situation en laboratoire.