La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est aujourd’hui l’une des techniques analytiques les plus utilisées en laboratoire pharmaceutique, agroalimentaire, environnemental et chimique. Elle permet de séparer, identifier et quantifier les composés d’un mélange avec une grande précision.
Comprendre la théorie est indispensable, mais la réussite en HPLC repose surtout sur la pratique. Les techniciens et analystes sont régulièrement amenés à interpréter un chromatogramme, calculer une résolution, vérifier un facteur de capacité, déterminer la concentration d’un analyte ou diagnostiquer une anomalie sur un système chromatographique.
Cette série d’exercices corrigés couvre les principales notions rencontrées en formation, en BTS, licence, master, école d’ingénieur ainsi que dans les laboratoires de contrôle qualité.
Objectifs de cette série d’exercices
À la fin de ces exercices, vous serez capable de :
- interpréter un chromatogramme ;
- calculer un temps de rétention ;
- déterminer un facteur de capacité (k’) ;
- calculer la résolution entre deux pics ;
- calculer le facteur de sélectivité α ;
- déterminer le nombre de plateaux théoriques ;
- calculer une concentration par étalonnage ;
- identifier les causes d’un mauvais chromatogramme ;
- choisir une colonne adaptée ;
- optimiser une méthode HPLC.
Exercice 1 — Identifier les éléments d’un chromatogramme
Énoncé
Le chromatogramme présente quatre pics.
Identifier :
- le temps mort (t₀)
- le temps de rétention (tR)
- l’aire du pic
- la hauteur du pic
Correction
Le temps mort correspond au passage d’un composé non retenu.
Le temps de rétention correspond au sommet du pic.
L’aire du pic représente la quantité de substance.
La hauteur du pic est utilisée dans certains calculs mais l’aire reste la mesure quantitative de référence.
Exercice 2 — Calcul du facteur de capacité
Énoncé
Temps mort :
1,2 min
Temps de rétention :
6,8 min
Calculer k’.
Correction
Formule :
k’ = (tR − t₀) / t₀
Calcul :
k’ = (6,8 − 1,2) / 1,2
k’ = 4,67
Le composé est correctement retenu.
Exercice 3 — Calcul de la résolution
Deux pics présentent :
tR₁ = 5,20 min
tR₂ = 5,90 min
Largeurs :
0,28 min
0,32 min
Calculer la résolution.
Correction
Rs = 2(tR₂−tR₁)/(w₁+w₂)
Rs = 2×0,70 /0,60
Rs = 2,33
Une résolution supérieure à 1,5 indique une excellente séparation.
Exercice 4 — Calcul du facteur de sélectivité
Calculer α.
k₁ = 2,6
k₂ = 3,8
Correction
α = k₂/k₁
α = 3,8 /2,6
α = 1,46
La colonne sépare correctement les deux composés.
Exercice 5 — Nombre de plateaux théoriques
Temps de rétention :
8,5 min
Largeur du pic :
0,24 min
Calculer N.
Correction
N = 16(tR/W)²
N = 16(8,5/0,24)²
N ≈ 20 080
La colonne possède une excellente efficacité.
Exercice 6 — Facteur d’asymétrie
Le facteur As mesuré est :
1,45
Interpréter.
Correction
Un facteur proche de 1 indique un pic symétrique.
Entre 1 et 1,5 :
pic acceptable.
Au-delà de 2 :
la méthode doit être optimisée.
Exercice 7 — Lecture d’un chromatogramme
Le chromatogramme présente :
- un pic à 3,2 min
- un pic à 7,6 min
- un pic à 11,8 min
Quel composé est élué en premier ?
Correction
Le composé ayant le temps de rétention le plus faible.
Réponse :
le premier pic.
Exercice 8 — Calcul d’une concentration
Équation d’étalonnage
y = 15432x + 218
Aire :
31250
Déterminer la concentration.
Correction
31250 = 15432x +218
x = 2,01 mg/L
Exercice 9 — Identifier une dérive de ligne de base
Le chromatogramme montre une ligne de base montante.
Quelle peut être la cause ?
Correction
Causes possibles :
- gradient
- température instable
- détecteur mal équilibré
- bulles d’air
- contamination
Exercice 10 — Pression anormalement élevée
La pression augmente progressivement.
Donner trois causes possibles.
Correction
- colonne bouchée
- filtre encrassé
- phase mobile contaminée
Exercice 11 — Temps de rétention instable
Pourquoi les temps de rétention changent-ils ?
Correction
- débit variable
- température fluctuante
- composition du gradient incorrecte
- fuite
Exercice 12 — Choix d’une colonne
Vous devez analyser :
Quelle colonne choisir ?
Correction
Une colonne C18 en phase inverse convient dans la majorité des cas.
Exercice 13 — Choix du détecteur
Quel détecteur utiliser pour :
Correction
Détecteur UV ou PDA.
Exercice 14 — Identifier un pic fantôme
Le chromatogramme présente un petit pic apparaissant dans tous les essais.
Quelle est la cause probable ?
Correction
- contamination
- mémoire de l’autosampler
- solvant impur
Exercice 15 — Calcul d’un rendement d’extraction
Avant extraction :
15 mg/L
Après extraction :
13,2 mg/L
Calculer le rendement.
Correction
Rendement = 13,2/15 ×100
88 %
Exercice 16 — Optimisation d’une séparation
Deux pics se chevauchent.
Comment améliorer la résolution ?
Correction
- diminuer le débit
- modifier le gradient
- changer la colonne
- diminuer la température
- augmenter la longueur de colonne
Exercice 17 — Identifier le meilleur chromatogramme
Comparer deux chromatogrammes :
A
Pics séparés.
B
Pics chevauchés.
Correction
Le chromatogramme A est préférable.
Exercice 18 — Validation d’une méthode
Quels paramètres doivent être validés ?
Correction
- exactitude
- fidélité
- précision
- linéarité
- robustesse
- spécificité
- LOD
- LOQ
Exercice 19 — Contrôle qualité
Une impureté dépasse la limite spécifiée.
Que faire ?
Correction
- vérifier l’étalonnage ;
- répéter l’analyse si la procédure le permet ;
- examiner le chromatogramme et les paramètres système ;
- rechercher une contamination éventuelle ;
- appliquer la procédure qualité du laboratoire avant toute décision concernant le lot.
Exercice 20 — Cas pratique complet
Énoncé
Une analyse HPLC donne :
- Temps mort : 1,0 min
- Pic A : 3,8 min
- Pic B : 5,9 min
- Largeur A : 0,22 min
- Largeur B : 0,31 min
- Aire du pic B : 42 350
- Équation d’étalonnage :
y = 18 200x + 450
Déterminer :
- Le facteur de capacité du pic B.
- La résolution entre A et B.
- La concentration correspondant au pic B.
Correction
1. Facteur de capacité
k’ = (5,9 − 1,0) / 1,0 = 4,9
2. Résolution
Rs = 2 × (5,9 − 3,8) / (0,22 + 0,31)
Rs = 2 × 2,1 / 0,53
Rs ≈ 7,92
La séparation est excellente.
3. Concentration
42 350 = 18 200x + 450
x = (42 350 − 450) / 18 200
x ≈ 2,30 mg/L
Conseils pour réussir les exercices HPLC
- 📖 Comprendre le rôle de chaque composant de l’appareil avant d’effectuer les calculs.
- 📊 Savoir lire un chromatogramme est aussi important que connaître les formules.
- 🧮 Vérifier les unités (minutes, mL/min, mg/L, µg/mL).
- 🧪 Maîtriser les principaux paramètres chromatographiques : temps de rétention, résolution, facteur de capacité, sélectivité, nombre de plateaux et asymétrie.
- ✅ Interpréter les résultats en tenant compte du contexte analytique et des critères d’acceptation du laboratoire.
Ces exercices avancés de chromatographie HPLC sont classés
en quatre niveaux. Chaque activité associe un énoncé, un schéma, une formule,
une correction détaillée et une interprétation analytique.
🟢 Niveau 1 — Initiation
Lecture d’un chromatogramme, temps mort, temps de rétention et ordre d’élution.
🔵 Niveau 2 — Intermédiaire
Facteur de capacité, résolution, sélectivité et efficacité de colonne.
🟠 Niveau 3 — Avancé
Étalonnage, dosage, rendement, validation et diagnostic chromatographique.
🔴 Niveau 4 — Expert
Développement de méthode, optimisation multicritère et investigation laboratoire.
Schéma global d’une analyse HPLC
🧴 Phase mobile
→
⚙️ Pompe
→
💉 Injection
→
🧪 Colonne
→
🔦 Détection
→
📈 Chromatogramme
Niveau 1 — Comprendre et lire un chromatogramme
Exercices d’initiation aux temps de rétention et à l’ordre d’élution.
Exercice 1 — Identifier les pics chromatographiques
Énoncé
Un mélange contient trois substances A, B et C. Le chromatogramme
montre trois pics aux temps suivants :
- Pic A : 2,4 min
- Pic B : 5,8 min
- Pic C : 8,1 min
Identifiez le premier composé élué et le composé le plus retenu.
Difficulté : facile Voir la correction
Le premier composé élué est A, car son temps
de rétention est le plus faible : 2,4 min.
Le composé le plus retenu est C, car il quitte
la colonne après 8,1 min.
L’ordre d’élution est donc :
A → B → C.
Schéma du chromatogramme
Temps de rétention →
Exercice 2 — Distinguer temps mort et temps de rétention
Énoncé
Une substance non retenue traverse la colonne en 1,1 min.
Un analyte apparaît à 6,3 min.
Déterminez le temps mort t0 et le temps de rétention
tR.
Voir la correction
Le temps mort correspond au passage d’une substance non retenue :
t0 = 1,1 min.
Le temps de rétention de l’analyte est :
tR = 6,3 min.
Repère temporel
Injection
0 min
→
Temps mort
1,1 min
→
Analyte
6,3 min
Niveau 2 — Calculer les performances chromatographiques
Facteur de capacité, résolution, sélectivité et nombre de plateaux.
Exercice 3 — Calcul du facteur de capacité k′
Données
- Temps mort : t0 = 1,2 min
- Temps de rétention : tR = 6,8 min
k′ = (tR − t0) / t0
Calculez le facteur de capacité.
Voir la correction
k′ = (6,8 − 1,2) / 1,2
k′ = 5,6 / 1,2 = 4,67
Le facteur de capacité est 4,67. Le composé
présente une rétention satisfaisante.
Lecture schématique
t0
1,2 min
→
Zone de rétention
5,6 min
→
tR
6,8 min
Exercice 4 — Calcul de la résolution entre deux pics
Données
- tR1 = 5,20 min
- tR2 = 5,90 min
- w1 = 0,28 min
- w2 = 0,32 min
Rs = 2 × (tR2 − tR1) / (w1 + w2)
Voir la correction
Rs = 2 × (5,90 − 5,20) / (0,28 + 0,32)
Rs = 1,40 / 0,60 = 2,33
La résolution est 2,33. Les deux composés sont
nettement séparés.
Interprétation visuelle
Deux pics séparés — Rs supérieur à 1,5
Exercice 5 — Calcul de l’efficacité de la colonne
Données
- Temps de rétention : 8,5 min
- Largeur du pic à la base : 0,24 min
N = 16 × (tR / w)²
Voir la correction
N = 16 × (8,5 / 0,24)²
N ≈ 20 069 plateaux
La colonne présente une efficacité élevée, sous réserve de
respecter la formule et le type de largeur de pic utilisés.
Effet de l’efficacité
Pic large
N faible
→
Pic étroit
N élevé
Niveau 3 — Dosage, validation et diagnostic
Étalonnage, concentration, rendement et anomalies de fonctionnement.
Exercice 6 — Calcul d’une concentration par étalonnage
Données
La droite d’étalonnage est :
y = 15 432x + 218
L’aire mesurée est y = 31 250.
Calculez la concentration x.
Voir la correction
x = (31 250 − 218) / 15 432
x ≈ 2,01 mg/L
La concentration de l’analyte est
2,01 mg/L.
Principe de l’étalonnage
Concentration connue
→
Aire du pic
→
Droite y = ax + b
→
Échantillon inconnu
Exercice 7 — Diagnostic d’une pression élevée
Situation
La pression initiale du système est de 145 bar. Après vingt
injections, elle atteint progressivement 230 bar.
Proposez une démarche de diagnostic logique.
Voir la correction
Étape 1 : vérifier la viscosité et la composition de la phase mobile.
Étape 2 : inspecter le filtre de ligne et la précolonne.
Étape 3 : déconnecter la colonne et contrôler la pression du système.
Étape 4 : examiner la colonne, le frit d’entrée et les risques de précipitation.
Étape 5 : vérifier la préparation et la filtration des échantillons.
Arbre de diagnostic
Pression élevée
→
Retirer la colonne
→
Pression normale ?
Oui
Colonne bouchée
Non
Circuit ou filtre bouché
Exercice 8 — Calcul d’un rendement d’extraction
Données
- Concentration théorique : 15 mg/L
- Concentration mesurée après extraction : 13,2 mg/L
Rendement = (C mesurée / C théorique) × 100
Voir la correction
Rendement = (13,2 / 15) × 100
Rendement = 88 %
Le rendement d’extraction est de 88 %.
Schéma du rendement
15 mg/L
avant extraction
→
Extraction
→
13,2 mg/L
récupérés
Niveau 4 — Développement de méthode et investigation
Cas avancés d’optimisation, séparation critique et décision analytique.
Exercice 9 — Optimiser deux pics partiellement coélués
Situation
Deux impuretés apparaissent à 7,42 min et 7,55 min. La résolution
mesurée est de 0,86. La méthode utilise :
- une colonne C18 de 100 mm ;
- un débit de 1,2 mL/min ;
- un gradient rapide ;
- une température de 40 °C.
Proposez quatre leviers d’optimisation et expliquez leur effet.
Voir la correction
1. Réduire la pente du gradient : augmente le
temps disponible pour séparer les deux impuretés.
2. Réduire le débit : peut améliorer les
échanges avec la phase stationnaire.
3. Tester une colonne plus longue : augmente
le nombre de plateaux théoriques.
4. Modifier la sélectivité : changer le pH,
le solvant organique ou la chimie de phase stationnaire peut
déplacer différemment les deux pics.
Leviers d’optimisation
Sélectivité α
Rétention k′
Efficacité N
pH
Gradient
Colonne
Débit
Température
Exercice 10 — Cas complet de conformité système
Données du contrôle
- Résolution minimale exigée : 1,5
- Résolution obtenue : 1,72
- Facteur d’asymétrie maximal : 2,0
- Facteur obtenu : 1,38
- RSD des aires maximal : 2,0 %
- RSD obtenu : 1,4 %
- Nombre minimal de plateaux : 5 000
- Nombre obtenu : 8 650
Le système est-il conforme ?
Voir la correction
La résolution de 1,72 est supérieure au minimum de 1,5.
Le facteur d’asymétrie de 1,38 est inférieur à la limite de 2,0.
Le RSD de 1,4 % respecte la limite de 2,0 %.
Le nombre de plateaux de 8 650 dépasse le minimum de 5 000.
Conclusion : le système est conforme aux quatre
critères présentés.
Grille de décision
Rs
✅ Conforme
Asymétrie
✅ Conforme
RSD
✅ Conforme
Plateaux
✅ Conforme
Exercice 11 — Investigation d’un résultat hors spécification
Situation professionnelle
Une impureté est mesurée à 0,28 %, alors que la spécification
maximale est de 0,20 %. Le chromatogramme présente également un
léger épaulement sur le pic principal.
Construisez une démarche d’investigation analytique sans conclure
immédiatement à la non-conformité du lot.
Voir la correction
1. Vérifier les données brutes : intégration,
identification du pic, paramètres de méthode et conformité du système.
2. Examiner la préparation : dilution,
pesée, verrerie, standard, filtration et stabilité des solutions.
3. Vérifier l’instrument : autosampler,
colonne, pression, carry-over et état du détecteur.
4. Examiner l’épaulement : rechercher une
coélution ou une intégration incorrecte.
5. Documenter l’investigation : appliquer la
procédure qualité du laboratoire avant toute répétition ou décision.
Schéma d’investigation
Résultat OOS
→
Données brutes
→
Préparation
Instrument
→
Méthode
→
Conclusion documentée
État du système Prêt
Pression 0 bar
Débit 1,00 mL/min
Température 30 °C
Temps d’analyse 0,0 min
HPLC System LC-240
Système en attente
🧴 Solvants Phase mobile
→
⚙️ Pompe Débit contrôlé
→
💉 Autosampler Injection
→
🧪 Colonne Séparation
→
🔦 Détecteur UV Acquisition
→
📊 CDS Intégration
Chromatogramme en temps réel Méthode prête
Pression calculée —
Résolution critique —
Nombre de plateaux —
Asymétrie —
Temps de rétention 1 —
Temps de rétention 2 —
RSD des aires —
Conformité système —
🔎 Diagnostic du laboratoire
Sélectionnez les paramètres de la méthode puis lancez l’analyse.
Le simulateur évaluera la pression, la résolution, l’efficacité et
la conformité du système.
🎯 Objectif de la mission
Obtenir une séparation exploitable tout en respectant les critères
de conformité du système chromatographique.
Résolution Viser Rs ≥ 1,50
Asymétrie Viser 0,80 à 1,80
RSD des aires Viser ≤ 2,00 %
🧪 Approfondir la chromatographie HPLC
Après ces exercices corrigés, poursuivez votre apprentissage avec le
guide pratique HPLC avec simulateurs et outils de laboratoire
.
Vous y trouverez des calculateurs chromatographiques, des schémas de fonctionnement,
des outils d’interprétation des chromatogrammes et un simulateur de situation en laboratoire.